4分子標(biāo)記鑒定法

廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式)。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納。由于DNA分子中堿基的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于長短與排列不一的重復(fù)序列等而產(chǎn)生多態(tài)性，DNA分子標(biāo)記便是檢測這種多態(tài)性的技術(shù)，故DNA分子標(biāo)記技術(shù)又稱作分子診斷技術(shù)。分子標(biāo)記能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。與上述三種鑒定法相比較，分子標(biāo)記具有許多明顯的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)為：(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；(2)數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測座位幾乎無限；(3)多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；(4)表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；(5)許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體，提供完整的遺傳信息。分子標(biāo)記的這些優(yōu)點(diǎn)，使它己廣泛用于植物分子圖譜的構(gòu)建、植物遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定、重要農(nóng)藝性狀基因定位與圖位克隆、轉(zhuǎn)基因植物鑒定、子標(biāo)記輔助育種選擇等生命科學(xué)的理論和應(yīng)用研究中。

生物在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了許多由DNA堿基序列變異所致的可遺傳變異。這些DNA堿基序列變異主要有DNA重排、堿基替換、缺失、插入、倒位、易位和序列重復(fù)等多種形式。分子標(biāo)記技術(shù)正是以物種內(nèi)這種存在著極為豐富的DNA堿基序列變異為基礎(chǔ)而開發(fā)起來的。

4．1 RFLP (Restr iction fragment length pOlymorphism，限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記）

該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立，1980年由Botstein再次提出，并由SOLLER和Botstein(1983)最先應(yīng)用于品種鑒別和品系純度的測定，這是第一個(gè)被應(yīng)用于遺傳研究的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。

RFLP是在分子克隆技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種遺傳標(biāo)記。特定生物類型的基因組DNA，經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理，就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變(新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn))和一段DNA的重新組織(如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化)等，均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP多態(tài)性。該技術(shù)包括以下基本步驟：DNA提��；用DNA限制性內(nèi)切酶消化；凝膠電泳分離限制性片段；將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上；用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交(稱Southern雜交)；放射性自顯影或酶學(xué)檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性，即可產(chǎn)生和獲得反映生物個(gè)體或群體特異性的RFLP圖譜。RFLP分析中所使用的探針，通常是隨機(jī)克隆的與被檢測物具有一定同源性的單拷貝或低拷貝基因組片段或cDNA片段。

RFLP指紋圖譜的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在：第一，可靠性較高。因?yàn)樗�由限制性�?nèi)切酶切割特定位點(diǎn)產(chǎn)生；第二，來源于自然變異。依據(jù)DNA上豐富的堿基變異無需任何誘變劑處理；第三，多樣性。通過酶切反應(yīng)在DNA水平上來反映所有差異，且RFLP標(biāo)記遍布于整個(gè)基因組，故而在數(shù)量上幾乎沒有任何限制；第四，共顯性。RFLP標(biāo)記能夠區(qū)別雜合體與純合體；第五，無表型效應(yīng)。不受發(fā)育階段及器官特異性限制。