蛋白質(zhì)是糧食的重要檢驗(yàn)指標(biāo)之一,它的測(cè)定通常利用經(jīng)典的凱氏定氮法。凱氏定氮法會(huì)用到的儀器有：定氮儀，又叫做蛋白質(zhì)測(cè)定儀。凱氏定氮儀分為全自動(dòng)和半自動(dòng)定氮儀。全自動(dòng)一次完成加堿、加硼酸、蒸餾，氨氣吸收整個(gè)過(guò)程，加硼酸和加堿的體積以及蒸餾和吸收過(guò)程的時(shí)間都可以自行設(shè)定。不需要再進(jìn)行人工操作，方便。但是對(duì)于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求很高的用戶來(lái)說(shuō)，還是推薦使用半自動(dòng)凱氏定氮儀。因?yàn)榘胱詣?dòng)凱氏定氮儀可以自行控制每個(gè)環(huán)節(jié)，包括時(shí)間、試劑等，能夠很好的掌握整個(gè)測(cè)定蛋白質(zhì)的過(guò)程。國(guó)標(biāo)中對(duì)凱氏定氮法檢測(cè)方法的介紹比較簡(jiǎn)單,操作中應(yīng)注意的事項(xiàng)也沒(méi)有介紹,這就給剛從事此項(xiàng)檢驗(yàn)的人員造成了一些困難,如果個(gè)別步驟操作不當(dāng)將直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。還有人認(rèn)為凱氏蒸餾裝置存在一定的不安全性,個(gè)別人不敢操作。筆者根據(jù)多方學(xué)習(xí)和多年的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定操作中不易掌握的個(gè)別步驟進(jìn)行了總結(jié),并對(duì)檢測(cè)裝置稍加改裝,提高了檢驗(yàn)的安全性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,對(duì)掌握蛋白質(zhì)的檢測(cè)有著良好的借鑒作用,現(xiàn)介紹如下(操作步驟參照GB/ T 5009. 522003) 。

1 　水蒸氣發(fā)生器的安全改裝

水蒸氣發(fā)生器的燒瓶瓶塞上一般有兩個(gè)導(dǎo)氣管,一個(gè)是通往反應(yīng)室的導(dǎo)氣管,還有一個(gè)安全導(dǎo)氣管。在蒸餾過(guò)程中,通往反應(yīng)室的導(dǎo)氣管的彈簧夾是放開(kāi)的,水蒸氣發(fā)生器燒瓶?jī)?nèi)氣壓基本能保持安全,但蒸餾完成后,通往反應(yīng)室的導(dǎo)氣管要馬上用彈簧夾夾死,水蒸氣發(fā)生器燒瓶又不能及時(shí)降溫,就會(huì)使水蒸氣發(fā)生器燒瓶?jī)?nèi)壓迅速增加,安全管太短沸水容易沸出傷人,沸水濺到電爐上易損壞電爐,安全管太長(zhǎng)易使水蒸氣發(fā)生器燒瓶?jī)?nèi)壓增大,水蒸氣發(fā)生器燒瓶容易爆裂傷人。

為了防止沸水溢出、水蒸氣發(fā)生器燒瓶爆裂,在水蒸氣發(fā)生器燒瓶的膠塞上再打一個(gè)孔,插上一段玻璃管(放氣管) ,玻璃管插入瓶塞深度以露出膠塞即可,切不可沒(méi)入水蒸氣發(fā)生器燒瓶液面以下,上端接上一小段膠管(改裝后水蒸氣發(fā)生器蒸餾燒瓶膠塞有安全管、導(dǎo)氣管、放氣管各一根) ,夾上彈簧夾,蒸餾時(shí)將放氣管夾子夾死,停止蒸餾時(shí),夾死通向反應(yīng)室導(dǎo)氣管的彈簧夾后馬上放開(kāi)放氣管彈簧夾,起到平衡蒸餾燒瓶?jī)?nèi)壓的作用,這樣既可防止沸水從安全管溢出,又能防止水蒸氣發(fā)生器燒瓶的爆裂。

2 　注意事項(xiàng)

2. 1 　凱氏燒瓶和試樣要求

稱取0. 1～5. 0g 樣品。如果稱1g 以上的樣品,就需要用大一些的凱氏燒瓶,最小500mL , 800～1000mL 的更好,這樣的凱氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間,加熱的均勻性和完全氨化效果較好。樣品應(yīng)是均勻的,若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì),液體樣要混合均勻。樣品放入凱氏燒瓶時(shí),不要黏附在瓶頸上,萬(wàn)一黏附可用少量水緩慢沖下,以免被檢樣消化不完全,導(dǎo)致結(jié)果偏低。

2. 2 　H2 SO4 和K2 SO4 的添加量

有機(jī)物分解需要濃H2 SO4 ,加入量應(yīng)根據(jù)試樣中有機(jī)物的種類、含量來(lái)定,如果試樣脂類含量高,則加H2 SO4 多。為了提高分解溫度,要適量添加K2 SO4 ,K2 SO4 添加太多,則溫度太高,生成的硫酸氫銨也會(huì)分解,放出氨而造成損失; K2 SO4 添加太少, 分解溫度過(guò)低, 消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。K2 SO4 和H2 SO4 的添加比例是: 1g 樣品, K2 SO4 ∶H2 SO4 =7g∶12mL 這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用,是公認(rèn)的。國(guó)標(biāo)中還有一種比例:1g 樣品, K2 SO4 ∶H2 SO4 = 6g∶20mL 。試樣在消化冷卻后呈固態(tài)則表明K2 SO4 用量過(guò)大,或H2 SO4 用量不足。

2. 3 　催化劑的選擇

用作催化劑的有Hg、HgO、Se 、硒化合物、CuSO4 、TiO2 , Hg 與HgO 有毒但結(jié)果好, Se 與CuSO4 得到結(jié)果基本是一致的, TiO2 的結(jié)果偏低;對(duì)于一般谷物的消化基本都采用CuSO4 作催化劑,CuSO4 作催化劑的好處是在蒸餾氨時(shí)可作為堿性反應(yīng)的指示劑。

2. 4 　指示劑的選取

1 份甲基紅乙醇溶液(1g/ L) 與5 份溴甲酚綠乙醇溶液(1g/ L) 臨用時(shí)混合。也可以用2 份甲基紅乙醇溶液與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。無(wú)論用哪種混合指示劑一定要在臨用時(shí)混合。在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。

2. 5 　NaOH的加入量

蒸餾前加入足量濃度為40 %的NaO H ,只有加入足量的NaO H 才能使氨氣全部溢出被硼酸吸收,防止樣液中氨氣逸出,否則測(cè)定值偏低。

2. 6 　熱源的強(qiáng)度

消化時(shí)熱源的強(qiáng)度和消化速度與試樣是否完全氨化關(guān)系很大,即使鹽類K2 SO4 加得多,如果熱源弱,也是沒(méi)有意義的,熱源過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致氨損失,使氨回收率低,另外凱氏瓶的容量大小,頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等,也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。在整個(gè)消化過(guò)程中,要保持和緩的沸騰,使火力集中在凱氏燒瓶底部,火力不能過(guò)猛,否則消化液爆沸使樣品黏附在定氮瓶壁上,黏附在定氮瓶壁上的蛋白質(zhì)在沒(méi)有硫酸存在的情況下,造成氮的損失。

2. 7 　消化的程度

消化液變?yōu)樘m綠色澄清透明,說(shuō)明消化完全。消化時(shí),如不能呈透明溶液,可將凱氏燒瓶放冷后,加入30 %過(guò)氧化氫2～3mL ,促使氧化,繼續(xù)消化30min 即可。

2. 8 　吸收液的濃度

一般用硼酸作為吸收液,濃度在3 %以上可將氨完全吸收,為保險(xiǎn)起見(jiàn)一般用4 %的硼酸。

2. 9 　蒸餾效果的判定

氨是否完全被蒸餾出來(lái),移開(kāi)氨吸收瓶,用p H試紙測(cè)定蒸餾出的液滴,如果不為堿性則說(shuō)明氨蒸餾徹底。