農(nóng)藥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料,在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中對(duì)病、蟲(chóng)、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用,為人類創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益,但同時(shí)也給環(huán)境安全和人體健康帶來(lái)了一定威脅. 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的殺蟲(chóng)劑農(nóng)藥主要可分為四大類:第一類是有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑,這類殺蟲(chóng)劑由于致畸、致癌和致突變等缺點(diǎn),已停止生產(chǎn)和使用;第二類是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑;第三類是氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑;第四類是擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑. 在所有的農(nóng)藥中,有機(jī)磷農(nóng)藥主要是殺蟲(chóng)劑,由于其品種多、防治對(duì)象多及殺蟲(chóng)效率高等特點(diǎn),而在各種農(nóng)作物尤其是水果蔬菜生產(chǎn)中得到最廣泛的應(yīng)用 . 有機(jī)磷農(nóng)藥中的部分品種具有高毒性的特點(diǎn),大量使用會(huì)造成環(huán)境污染、作物藥害及人畜中毒. 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年農(nóng)藥中毒人數(shù)約300 萬(wàn)人,其中有機(jī)磷農(nóng)藥中毒占70 %. 我國(guó)專家對(duì)為數(shù)眾多的農(nóng)藥品種進(jìn)行分級(jí)排隊(duì),從中篩選出的十種強(qiáng)污染農(nóng)藥中,有七種屬于有機(jī)磷類,可見(jiàn),農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重點(diǎn)應(yīng)該放在有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑.目前,我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用最多的是酶抑制法,其較高的專一性、靈敏性和準(zhǔn)確性及低成本等優(yōu)點(diǎn)已受到人們的廣泛關(guān)注. 筆者主要針對(duì)乙酰膽堿酯酶和植物酯酶兩種酶在快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用研究作一綜述.

1. 1 　有機(jī)磷農(nóng)藥的特點(diǎn)

早在20 世紀(jì)30 年代,德國(guó)的Schrader 就合成了一系列有機(jī)磷酸酯類化合物,并發(fā)現(xiàn)其中一些具有殺蟲(chóng)殺螨活性. 目前全世界有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的品種約為100 余種,常用的有50 多種. 我國(guó)農(nóng)藥市場(chǎng)上有機(jī)磷品種30 余個(gè),占我國(guó)殺蟲(chóng)劑品種的38 % ,而產(chǎn)量卻占75 %. 有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑作為我國(guó)使用最廣泛、用量最大的一類殺蟲(chóng)劑,有機(jī)農(nóng)藥一般都會(huì)殘留在土壤、或飲用水中，然后通過(guò)生物鏈進(jìn)入植物、動(dòng)物體內(nèi)，再到人體內(nèi)。那么如何去測(cè)定土壤中農(nóng)藥的殘留量，我們可以通過(guò)測(cè)土儀來(lái)測(cè)定。它可以測(cè)出氮、磷的含量，從而推斷出是否含有農(nóng)藥成分。農(nóng)藥品種繁多,性能也千差萬(wàn)別. 綜合起來(lái)主要具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn):

(1) 在自然環(huán)境和動(dòng)植物體內(nèi)易降解. 正確使用時(shí)殘留問(wèn)題小,不致污染環(huán)境且在高等動(dòng)物體內(nèi)無(wú)累積毒性; (2) 殺蟲(chóng)效率高,廣譜,作用方式多樣(如觸殺、胃毒、熏蒸) ; (3) 毒性差異大. 辛硫磷、馬拉硫磷及敵百蟲(chóng)等毒性低,而對(duì)硫磷、甲拌磷為劇毒品種.總的來(lái)說(shuō),有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的毒性偏高; (4) 易解毒.對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑引起的急性中毒有特效的解毒藥,如解磷定和阿托品; (5) 與有機(jī)氯農(nóng)藥、擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑相比,害蟲(chóng)對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗藥性發(fā)展緩慢.

1. 2 　有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性

作為典型的酶毒劑,有機(jī)磷農(nóng)藥可以通過(guò)消化道攝入,也可以通過(guò)皮膚、粘膜、呼吸道吸收. 有機(jī)磷的急性毒性主要?dú)w因于對(duì)膽堿能神經(jīng)突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶活性的抑制,使酶不能起催化乙酰膽堿水解的作用,導(dǎo)致組織中能使神經(jīng)過(guò)度興奮的乙酰膽堿過(guò)量蓄積. 這種乙酰膽堿傳導(dǎo)介質(zhì)代謝紊亂,可導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)毒性,引起運(yùn)動(dòng)失調(diào)、昏迷、呼吸中樞麻痹、癱瘓甚至死亡. 有實(shí)驗(yàn)證明對(duì)氧磷和對(duì)硫磷�；�人腦膽堿酯酶一般約經(jīng)4 d 即“老化”,酶活不易再恢復(fù).

目前檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留普遍采用的方法有:色譜法、波譜法和酶抑制法. 色譜法檢測(cè)準(zhǔn)確,靈敏度高,但成本高,測(cè)定時(shí)間長(zhǎng),且需要具有一定技術(shù)水平的專業(yè)人員才能進(jìn)行操作,只適合在實(shí)驗(yàn)室分析;波譜法干擾因素多,靈敏度不高,易出現(xiàn)假陰性結(jié)果,一般只能作為鑒別方法粗選;酶抑制法具有操作簡(jiǎn)便,速度快,適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大批樣品篩選檢測(cè)和我國(guó)小規(guī)模、分散的銷售體系中經(jīng)常性的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),因此作為一種檢測(cè)農(nóng)藥的常用方法得到廣泛應(yīng)用. 而如何選擇酶源是實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的關(guān)鍵.

2. 1 　酶的來(lái)源

膽堿酯酶廣泛存在于動(dòng)物的組織中,1953 年stedman 等首先從馬血清中分離出乙酰膽堿酯酶,此后不同來(lái)源的乙酰膽堿酯酶相繼得到純化和研究 . 目前已分離純化的動(dòng)物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶主要集中在動(dòng)物肝臟和血液,如豬肝,雞血等. 也有利用蚯蚓以及海洋魚(yú)類,甲殼類動(dòng)物的神經(jīng)組織,腦組織分離乙酰膽堿酯酶. 近年來(lái)很多學(xué)者致力于從昆蟲(chóng)體內(nèi)提取乙酰膽堿酯酶如:家蠅、麥二叉蚜、黃猩猩果蠅、煙草天蛾、光葉庫(kù)蚊、黃粉甲、美洲淤夜蛾、豆莢草盲蝽、馬鈴薯葉甲、騷擾角蠅及棉鈴蟲(chóng)等. 迄今為止,酶抑制法進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)以從敏感家蠅中提取的乙酰膽堿酯酶效果最佳,其敏感性優(yōu)于其他來(lái)源的乙酰膽堿酯酶,更有進(jìn)一步研究表明,家蠅羽化后2～3 d 時(shí)其頭部的乙酰膽堿酯酶敏感性最高.植物來(lái)源的酯酶作為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的三種酶標(biāo)記物之一,由于其來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉,近年來(lái)得到了較多的關(guān)注. 但是,幾乎所有的研究都是直接以面粉作為酶源,篩選用于農(nóng)殘檢測(cè)的最佳小麥品種或者是以面粉作為酶標(biāo)記物,制成酶片,對(duì)酶片檢測(cè)農(nóng)殘顯色反應(yīng)的溫度、時(shí)間、顯色劑的選擇等方面進(jìn)行比較研究. 尚未見(jiàn)到用提取純化的純酯酶制品對(duì)大量有機(jī)磷農(nóng)藥的敏性和最低檢測(cè)限進(jìn)行研究的報(bào)道.

2. 2 　兩種酶抑制法的比較研究

酶抑制法測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性對(duì)酶分解底物的抑制作用進(jìn)行的,其酶源有來(lái)自動(dòng)物的膽堿酯酶和從植物中提取的植物酯酶.動(dòng)物膽堿酯酶法是基于有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性抑制乙酰膽堿酯酶催化底物水解生成乙酸和膽堿,后者與5 ,52二硫代2雙222硝基苯甲酸反應(yīng),生成黃色產(chǎn)物52硫代222硝基苯甲酸,其在410 nm 處有最大吸收,測(cè)定其在單位時(shí)間內(nèi)的生成量,即可測(cè)得乙酰膽堿酯酶的活性.植物酯酶可以催化乙酸萘酯水解為萘酚和乙酸,萘酚與顯色劑固藍(lán)B 作用形成紫紅色的偶氮化合物,從而發(fā)生顯色反應(yīng)。

有機(jī)磷農(nóng)藥能抑制植物酯酶的活性,使反應(yīng)速率發(fā)生變化,紫紅色的偶氮化合物產(chǎn)量不同,吸光度值也不同,即酶的活性受到抑制的程度不同.很多學(xué)者經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn),比較了動(dòng)物酯酶和植物酯酶反應(yīng)的條件、總酯酶活力和靈敏度,并對(duì)其檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化,如2004 年黃志勇等比較了快速測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)殘的膽堿酯酶抑制法和植物酯酶抑制法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酶抑制快速測(cè)定方法均可用于蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)殘的測(cè)定,其加標(biāo)回收率都達(dá)到85 %以上,但植物酯酶法的測(cè)定偏差小于3 %,精密度較前者更勝一籌. 而后對(duì)植物酯酶和動(dòng)物酯酶在不同p H 值下的酶活、抑制程度等性質(zhì)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究也表明了動(dòng)物酯酶中的蒼蠅酶、蠅蛆酶與植物酯酶中的小麥酯酶相比,它們的活力和被農(nóng)藥抑制程度處于相近的水平,蒼蠅酯酶在p H 為6. 5時(shí)抑制程度最大為71 % ,植物酯酶在p H 為6. 0 時(shí)抑制程度達(dá)到了73 %. 植物酯酶抑制法對(duì)久效磷、樂(lè)果及辛硫磷的最低檢出限范圍為0. 03～0. 40mg/ kg ,而動(dòng)物酯酶抑制法對(duì)相應(yīng)農(nóng)藥的最低檢出限為0. 04～0. 50 mg/ kg . 可見(jiàn),植物酯酶與動(dòng)物酯酶均可用于蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定,與動(dòng)物酯酶相比,植物酯酶的酶活、抑制程度等各項(xiàng)指標(biāo)均不遜色,且具有來(lái)源方便、成本低的優(yōu)勢(shì).

2. 3 　動(dòng)物膽堿酯酶法

自從1951 年發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥在體外也能抑制膽堿酯酶以來(lái),絕大多數(shù)研究都是基于動(dòng)物膽堿酯酶這一原理進(jìn)行的. 目前,膽堿酯酶法檢測(cè)有機(jī)磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及膽堿酯酶生物傳感器法.

2. 3. 1 　酶片法

酶片法是將敏感生物的膽堿酯酶和生色基質(zhì)液經(jīng)固化處理后加載到濾紙片或類似載體物質(zhì)上,基質(zhì)在膽堿酯酶的催化作用下迅速分解,生成膽堿(藍(lán)色) 和乙酸. 有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用,使催化、水解、變色的過(guò)程發(fā)生改變. 若膽堿酯酶受到抑制,基質(zhì)就不能水解、不變色,表明樣品中含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥(呈陽(yáng)性) . 目前廣泛使用的速測(cè)箱、速測(cè)卡法均屬于酶片法.近年來(lái)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的用固化含有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的試紙片建立的適合我國(guó)蔬菜中部分農(nóng)藥殘留限量的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督檢測(cè)的速測(cè)卡法,其檢出限一般在0. 3～3. 5 mg/ kg ,檢出時(shí)間為15 min 操作簡(jiǎn)單,速度快,測(cè)試成本低廉. 也有學(xué)者利用馬血清中的乙酰膽堿酯酶與底物氯化乙酰膽堿作用,根據(jù)反應(yīng)前后的p H 值變化及指示劑的顏色變化情況,建立的一種可以作定性及半定量分析的酶片快速檢測(cè)法,應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)黃瓜中農(nóng)殘的效果較好. 在國(guó)外方面,Hwa2Young No 和Young Ah Kim等用涂有乙酰膽堿酯酶的試紙檢測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留的含量,實(shí)驗(yàn)表明以Hybond N + 為酶載體,苯基乙酸酯為底物最合適,此時(shí)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限分別為10 - 6 ～102 μg/ mL 和10 - 6 ～100μg/ mL ,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn):與對(duì)氧磷相比,試紙法對(duì)被氧化的對(duì)氧磷更敏感.

2. 3. 2 　酶抑制分光光度法

有機(jī)磷類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶活性有抑制作用,濃度越高,抑制率越高. 通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值,并與空白對(duì)照比較求得酶抑制率,從而判定樣品中是否有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在. 該法所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短, 可及時(shí)檢測(cè)含農(nóng)殘的蔬菜.曾有報(bào)道以雞腦為酶源提取乙酰膽堿酯酶,利用酶抑制分光光度法檢測(cè)油白菜中有機(jī)磷農(nóng)藥(對(duì)硫磷、辛硫磷、氧化樂(lè)果) 的殘留量,可使3 種農(nóng)藥的回收率分別達(dá)到97 % , 101 %和99 %. IngridWalt 等從鐮刀菌pisi 中提取角質(zhì)酶,利用酶抑制分光光度法和96 孔板法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑的含量,該法對(duì)毒死蜱和對(duì)氧磷的檢測(cè)限分別為2. 6 mg/ L 和0. 04 mg/ L .

2. 3. 3 　膽堿酯酶生物傳感器

膽堿酯酶生物傳感器法是目前農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)中的研究熱點(diǎn),其在研究方法多樣化、靈敏度、準(zhǔn)確性、響應(yīng)時(shí)間等方面都具有很大優(yōu)勢(shì).

(1) 電化學(xué)型:電化學(xué)型生物傳感器是基于膽堿酯酶催化底物水解生成電活性物質(zhì)的反應(yīng)而構(gòu)建. 通常采用電化學(xué)氧化法直接測(cè)定生成的巰基膽堿或者先用膽堿氧化酶氧化生成的膽堿,進(jìn)一步用電化學(xué)方法測(cè)量在此催化氧化過(guò)程中消耗的O2 或生成的H2O2 . Andreescu 等以果蠅中提取的膽堿酯酶為酶源,以苯乙酸酯為底物,Ag/ Al 參考電極,研制了一種絲網(wǎng)印刷電化學(xué)傳感器,其對(duì)對(duì)氧磷和毒死蜱的檢測(cè)限分別為5. 2 ×10 - 3 mg/ L 和0. 56 ×10 - 3 mg/ L .

(2) 光化學(xué)型:構(gòu)建光化學(xué)型生物傳感器的基礎(chǔ)是膽堿酯酶催化底物水解生成光活性物質(zhì)的反應(yīng). 在酶水解底物乙酰膽堿過(guò)程中,生成的乙酸引起溶液p H 降低,可引起p H 指示劑溴甲酚紫的顏色變化. 根據(jù)這一原理,已構(gòu)建了一種具有三層生物活性膜的“三明治”型生物傳感器. 膽堿酯酶被固定在外層的經(jīng)親水修飾的聚偏氟乙烯膜上,中間層為同溴甲酚紫混在一起的溶膠凝膠層, 下層為玻璃片. 同樣,也有根據(jù)溶液p H 降低引起p H 指示劑氯酚紅顏色變化的原理,將AChE 及氯酚紅分別共價(jià)固定在可控多孔玻璃球上,建立了一種流動(dòng)式注射分析方法. Pardo2Yissar 等則設(shè)計(jì)了一種AChE 與經(jīng)化學(xué)修飾的CdS 納米離子相結(jié)合的光電流傳感系統(tǒng). 在AChE 抑制劑存在情況下,AChE的催化活性受到抑制,水解產(chǎn)物巰基膽堿的量降低,引起光電流減小. 這種酶與CdS 納米離子聯(lián)合的光電流傳感系統(tǒng)有可能發(fā)展為一類通用的生物傳感模式.

(3) 壓電型:設(shè)計(jì)壓電型生物傳感器的基本思路就是將膽堿酯酶(ChE) 或其抑制劑固定于石英晶體表面,當(dāng)待測(cè)的ChE 及其抑制劑與所固定的識(shí)別物相互作用而產(chǎn)生特異結(jié)合時(shí),將導(dǎo)致晶體表面質(zhì)量負(fù)載的改變,通過(guò)傳感器的頻率變化加以檢測(cè).Abad 等采用直接吸附和共價(jià)結(jié)合兩種方式將AChE 固定在石英晶體表面制成壓電生物傳感器.利用有機(jī)磷抑制固定化的AChE 與吲哚乙酸生成不溶性靛藍(lán)染料的反應(yīng),測(cè)定壓電晶體的振蕩頻率的變化. Makower 等建立了一種競(jìng)爭(zhēng)親合分析法,對(duì)氧磷作為識(shí)別元件通過(guò)螯合作用被固定在壓電傳感器金電極的表面. 經(jīng)過(guò)對(duì)氧磷修飾后的表面可以同BChE 結(jié)合,當(dāng)樣品中存在殺蟲(chóng)劑時(shí),電極表面結(jié)合的BChE 量就會(huì)減少 . ChE 可以與可卡因類化合物相結(jié)合,酶催化速率水解常數(shù)非常小. 基于此,Knosche 等將可卡因的衍生物苯甲酰愛(ài)岡寧(benzoylecgonine) 固定在壓電晶體表面,并研究了其與AChE 結(jié)合的動(dòng)力學(xué)特性,結(jié)果表明,苯甲酰愛(ài)岡寧可作為親和配基用于生物傳感分析.Nunes 等制成了膽堿酯酶(ChE) 的電流型生物傳感器,可用于谷物等樣品中氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑涕滅威、西維因、滅多蟲(chóng)和殘殺威的測(cè)定,測(cè)定線性范圍為5 ×10 - 5μg/ g ,檢測(cè)限為1 ×10 - 4 ～3. 5μg/ g.Holger Schulze 等將AchE2傳感器直接應(yīng)用于以N2溴代丁二酰亞胺為氧化劑,以異辛烷為萃取劑萃取的植物樣本,此法檢測(cè)時(shí)間為2 h ,重復(fù)率為84 %,對(duì)氧磷的檢測(cè)限可達(dá)2 μg/ kg ,達(dá)到歐盟食品農(nóng)藥殘留的安全限值。

2. 4 　植物酯酶抑制法

酶法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法中,多采用敏感家蠅頭部獲得的乙酰膽堿酯酶,但是動(dòng)物酯酶常表現(xiàn)為保持期短,需冷凍低溫保存. 而植物酯酶酶源豐富,提取和保存較為方便,只需以一定比例的水或緩沖液混合離心獲得的上清液即可作為粗酶液,并在- 4 ℃保存即可. 而且與動(dòng)物酯酶相比,植物酯酶抑制法的測(cè)量準(zhǔn)確度和精密度均不遜色,能達(dá)到快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的目的.

1987 年,中國(guó)農(nóng)業(yè)部環(huán)保所研制出一種酶片和顯色基質(zhì)片,不需儀器,即可在田間或菜市場(chǎng)快速測(cè)定蔬菜和水果中的有機(jī)磷類農(nóng)藥,其檢測(cè)限為0. 5～10 mg/ kg. 而后有人利用自制的植物酶片和高靈敏度化學(xué)檢測(cè)液(速測(cè)靈) ,使檢測(cè)出有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的靈敏度達(dá)到0. 4～10 mg/ L 和0. 18～10 mg/kg ,檢測(cè)時(shí)間為5～10 min ,檢測(cè)成本為0. 2～0. 3元人民幣. 至此,植物酯酶法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留開(kāi)始受到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注,各方面的研究也隨即展開(kāi).

在酶源的篩選方面,依據(jù)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性而定,許多研究者直接從面粉中提取酶,但不同的小麥酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性不同即使對(duì)于同一品種小麥,產(chǎn)地不同、種植方法不同、所處生長(zhǎng)期不同時(shí),其對(duì)農(nóng)藥的敏感度也會(huì)存在較大差異. 因此,需要作進(jìn)一步的研究,以確定可以進(jìn)行定量分析而且具有互換性的植物酯酶酶源.

在顯色液方面,由于酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留常需借助于固藍(lán)B 鹽和乙酸萘酯組成的生色基質(zhì)液的顯色完成. 但該顯色液非常不穩(wěn)定,在室溫下40min 以后顯色能力大大下降,不能再用來(lái)測(cè)定,需現(xiàn)用現(xiàn)配,這給檢測(cè)工作帶來(lái)了諸多不便. 為此,董劑,大大延長(zhǎng)了顯色劑的有效使用期限,使其在室溫下放置3 個(gè)月后性能不變,且該法對(duì)甲胺磷、敵敵畏、對(duì)硫磷及辛硫磷等的檢出體積分?jǐn)?shù)為10 - 4 ～10 - 7 . 也有學(xué)者改用其它顯色劑如2 ,62二氯乙酰靛酚,先用植物酯酶水解橙色的2 ,62二氯乙酰靛酚,然后用分光光度法測(cè)定分解的靛酚(藍(lán)色) 吸光度,計(jì)算可得有機(jī)磷的含量,該法對(duì)常用的幾種有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測(cè)定限均在0. 001 5～0. 3300 mg/ L 范圍內(nèi). 通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)比較兩種不同顯色劑(2 ,62二氯靛酚乙酯和固藍(lán)B 鹽) 的顯色原理與性能,證實(shí)了采用2 ,62二氯靛酚乙酯既兼顧了底物和顯色劑的雙重作用,且從顯色底物液使用的方便程度、穩(wěn)定性以及便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等方面看,使用2 ,62二氯靛酚乙酯顯色劑比用固藍(lán)B 鹽來(lái)顯色更具有優(yōu)越性.

進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)了小麥酯酶活性與保存溫度的關(guān)系:在20 ℃儲(chǔ)存5 d 酶活只剩39. 6 %,在4 ℃儲(chǔ)藏5 d 剩余75. 6 %,酶活衰退較快,而將該酶用液氮在- 196 ℃保存8 d ,酶活仍有97. 5 % ,可見(jiàn)酶的保存需要較低的溫度. 近年來(lái)研究人員主要利用酶固定化技術(shù)解決酶液難以貯藏的問(wèn)題,如用離子交換樹(shù)脂作為固定化載體對(duì)植物酯酶進(jìn)行固定化,不僅可使酶的穩(wěn)定性大大提高,而且與游離酯酶相比,對(duì)農(nóng)藥抑制的響應(yīng)敏感性也有明顯的提高.也有選用聚苯乙烯微孔反應(yīng)板作為酶的載體,將自制的植物酯酶固定在載體上的微孔內(nèi)壁表面,制成農(nóng)藥快速檢測(cè)板,檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度可達(dá)0. 01～0. 1 mg/ kg . 最近有報(bào)道采用原位溶膠2凝膠法制備PVA/ SiO2 有機(jī)/ 無(wú)機(jī)雜化溶膠,并將顯色劑和植物酯酶分散于溶膠中,制成一類親水2親丙酮可調(diào),貯存性好的傳感膜. 固定于該雜化膜中酶的穩(wěn)定性在冷藏和室溫條件下均比在溶液狀態(tài)下有明顯提. 由此可見(jiàn),酶的固定化方法在檢測(cè)農(nóng)藥殘留中將起到非常重要的作用.

隨著人們對(duì)蔬菜中農(nóng)藥殘留及食品安全性問(wèn)題的關(guān)注,只有不斷地更新和完善農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)技術(shù),才能滿足人類對(duì)健康和食品貿(mào)易的要求. 而酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留相對(duì)于傳統(tǒng)的波譜法,色譜法在簡(jiǎn)便、快速和檢測(cè)成本等方面都有較大的優(yōu)越性. 基于動(dòng)物膽堿酯酶的酶片法、分光光度法以及生物傳感器法,準(zhǔn)確性和靈敏度尚好,其中近年來(lái)的研究熱點(diǎn)———生物傳感器法,我國(guó)還停留在研發(fā)階段,應(yīng)著力解決其穩(wěn)定性、精確性等問(wèn)題盡快將研究成果投入實(shí)際運(yùn)用. 而相對(duì)于動(dòng)物酶法,植物酯酶法在提取、保存、檢測(cè)成本上更勝一籌,且靈敏度和準(zhǔn)確性上也不遜色,故在我國(guó)推廣很快. 但是不同的植物酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制強(qiáng)度不同,應(yīng)探索更有效的分離純化方法并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,明確作用靶標(biāo)部位,以期更大程度地提高植物酯酶的檢測(cè)靈敏度. 同時(shí),應(yīng)著力研制便宜、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的速測(cè)儀器, 力求把殘毒超標(biāo)的蔬菜、水果堵在食用之前.